La realización de estudios toxicológicos constituye un requisito indispensable para el desarrollo de un nuevo producto, bien sean productos químicos –sujetos a la normativa REACH-, medicamentos –sujetos a las normativa de Agencias Reguladoras: EMA, FDA, Normas ICH-, o productos sanitarios –sujetos a normas ISO-. En el departamento de toxicología contamos con una amplia experiencia en el desarrollo preclínico de nuevos compuestos, la cual está asociada a un alto porcentaje de éxito en productos que alcanzan la fase clínica.

En nuestro centro ofertamos una amplia gama de estudios in vivo realizados bajo Buenas Prácticas de Laboratorio (BPLs -hipervínculo-), abarcando la batería de estudios exigida por las Agencias Reguladoras para el desarrollo preclínico de cualquier producto nuevo, de cara a su posterior lanzamiento al mercado.

De forma adicional, ofrecemos servicios en fases previas al desarrollo del producto, también conocidas como fases de screening, destinadas a la selección de los mejores candidatos para su evaluación preclínica posterior. Dentro de este apartado se incluye la realización de estudios GLP-like, los cuales pueden estar orientados a distintos objetivos: la toma de decisiones a la hora de elegir o descartar candidatos, la planificación de estudios y tiempos en fases preclínicas para asegurar el cumplimiento de todos los requerimientos de las Agencias Reguladoras, la selección del modelo animal o la realización de estudios de eficacia, entre otros. En resumen, un asesoramiento personalizado para contar con la certeza de que el desarrollo del producto se está realizando dentro del marco legal y evitar sobrecostes posteriores generados por fallos en las fases de diseño previas.

Nuestro cualificado personal técnico está especializado en el trabajo con varios sistemas experimentales in vivo (roedores y no roedores) y tiene a su disposición modernos edificios de estabulación que cumple con todos los requisitos europeos de estabulación y manipulación de animales. Nuestros expertos en bienestar animal velan por el correcto estado sanitario de los animales y su bienestar.

Actualmente disponemos de los siguientes estudios normalizados;

• Estudio de escalada de dosis o toxicidad aguda

• Estudio de toxicidad a dosis repetida -14 o 28 días-

• Estudio de toxicidad a dosis repetida -90 días, 6 o 9 meses-

Además de los anteriormente citados, diseñamos estudios según las necesidades que puedan tener nuestros clientes en todas las fases del desarrollo preclínico de un fármaco.

Estudio de escalada de dosis o toxicidad aguda

Los primeros estudios que deben realizarse, cuando no exista bibliografía al respecto, son los estudios de escalada de dosis (o estudios de toxicidad aguda), que forman parte de los denominados estudios de toxicidad general. En el caso del desarrollo de medicamentos y de productos sanitarios, de acuerdo a la ICH Harmonised Tripartite Guideline M3 (R2)[1] y Norma ISO 10993-1[2] respectivamente, estos estudios permiten determinar la dosis máxima a utilizar en estudios posteriores de toxicidad a dosis repetidas.

Estudio de toxicidad a dosis repetida -14 o 28 días-

En la valoración y evaluación de las características tóxicas de una sustancia, después de un primer estudio de escalada de dosis (o de toxicidad aguda), se requiere una evaluación de la relación dosis del producto-efecto tóxico, en dos especies animales (una roedora y una no roedora), tras su administración a dosis repetidas. El número de dosis -14 o 28 días - dependerá del uso, exposición o posología clínica prevista, tal y como recogen las normas vigentes.

Estudio de toxicidad a dosis repetida -90 días, 6 o 9 meses-

En la valoración y evaluación de las características tóxicas de una sustancia, después de un primer estudio de escalada de dosis (o de toxicidad aguda), se requiere una evaluación de la relación dosis del producto-efecto tóxico, en dos especies animales (una roedora y una no roedora), tras su administración a dosis repetidas. El número de dosis -90 días, 6 o 9 meses - dependerá del uso, exposición o posología clínica prevista, tal y como recogen las normas vigentes.

De acuerdo con la legislación vigente, para todos aquellos productos de aplicación dérmica (área dermatología), es necesario realizar estudios de tolerancia para descartar posibles efectos adversos del producto sobre el organismo. Concretamente, se exige la realización de al menos un estudio de tolerancia dérmica a dosis única y un estudio de tolerancia dérmica a dosis repetidas que además aporte datos de toxicidad general. Por último, y puesto que el producto puede contactar de forma accidental con los ojos, es necesario realizar un estudio de tolerancia ocular, a dosis única.

El objetivo principal es el de detectar un posible efecto corrosivo o irritante por parte del fármaco o producto de ensayo, así como determinar en qué grado es capaz de afectar al sistema experimental. Por ello es necesario evaluar las lesiones dérmicas que pueda provocar y comprobar si existe la posibilidad de que éstas sean reversibles.

Para alcanzar estos objetivos, nuestro centro cuenta con los requerimientos legales que exigen las agencias reguladoras para realizar estudios normalizados de tolerancia, entre los cuales se incluyen los siguientes:

• Estudio de tolerancia dérmica a dosis única y repetida

• Estudio de tolerancia ocular a dosis única y repetida

• Estudio de tolerancia parenteral a dosis única y repetida

• Estudio de tolerancia vaginal a dosis única y repetida

• Estudio de tolerancia bucal a dosis única y repetida

• Estudio de tolerancia nasal a dosis única y repetida

• Ensayo del Nódulo Linfático Local: DA (LLNA:DA)

El ensayo no radiactivo del nódulo linfático local es un ensayo que permite identificar potenciales sensibilizadores cutáneos, mediante la determinación de la proliferación celular producida en el nódulo linfático local. De esta manera será posible cuantificar la respuesta local que genera el organismo frente a la aplicación de un producto de ensayo por vía dérmica.

• Estudio de reactividad intradérmica

Este estudio es especialmente efectivo a la hora de conocer en profundidad y valorar el potencial de un producto para desarrollar una respuesta de sensibilización (o hipersensibilidad) tras su administración intradérmica. Gracias a la especificidad técnica de la prueba, se hace posible precisar al máximo los efectos irritantes que pueda causar un determinado producto en la piel, haciendo de este ensayo una prueba indispensable en el desarrollo de un nuevo producto.

Este Departamento ofrece la posibilidad de obtener muestras biológicas de sistemas experimentales in vivo, para la realización de análisis posteriores. Nuestros laboratorios cuentan para ello con la certificación oficial del Gobierno de Navarra que acredita el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPLs), exigidas por la legislación española.

De forma complementaria, el laboratorio de Toxicología colabora con otros departamentos y secciones de la Universidad para ampliar la oferta de posibilidades de análisis tras la obtención de muestras biológicas. 

• Estudio de farmacocinética

Los estudios de farmacocinética (PK) permiten determinar la evolución de la concentración del producto de ensayo en una matriz biológica, desde su administración hasta su eliminación. De esta forma, aportan información acerca de su absorción, distribución, metabolismo y excreción en el organismo y permiten caracterizar su perfil cinético.

• Estudio de toxicocinética

En la valoración y evaluación de las características tóxicas de una sustancia, junto con los estudios de toxicidad a dosis repetida, se requiere la realización de un estudio toxicocinético (TK) que permita relacionar la exposición al producto con los hallazgos toxicológicos, contribuyendo a la evaluación de la relevancia de estos hallazgos para la seguridad clínica y aportar información sobre el potencial de acumulación del fármaco.

Ensayo del cometa

Este ensayo se utiliza para evaluar la capacidad genotóxica de un compuesto. La genotoxicidad en este caso, se detecta en base al número de roturas en el ADN que pueda llegar a producir el compuesto estudiado. En nuestro departamento, se ensayan dos modelos de este test, el estándar y el realizado en combinación con la enzima FPG, que permite también detectar bases oxidadas y alquiladas. Se trata de un método en alza, capaz de detectar genotoxicidad de forma muy precisa y eficaz.

Como empresa puntera en la ejecución de esta técnica, el departamento ofrece distintas opciones para la realización de este tipo de ensayo. Existen varias variantes del mismo, las cuales permiten realizar el test tanto en células obtenidas in vitro, como en células obtenidas in vivo, existiendo la posibilidad en esta última variante de emplear células procedentes de tejidos frescos o congelados.

Ensayo del micronúcleo

Se trata de un ensayo capaz de detectar los efectos genotóxicos que presenta un compuesto sobre un determinado tipo celular a través de la presencia de micronúcleos (MN), pequeños núcleos independientes y adicionales al núcleo principal de las células, relacionados con la presencia de aberraciones cromosómicas estructurales o numéricas.

Esta técnica está desarrollada para realizarse tanto en células obtenidas in vitro, como en células obtenidas in vivo.

Una parte muy importante de la caracterización de un fármaco es conocer sus posibles efectos genotóxicos. La capacidad de un fármaco para inducir daños a nivel genético puede derivar en problemas serios de salud, llegando a ser responsables del desarrollo de enfermedades de pronóstico muy grave.

Por ello, es esencial detectar lo antes posible este tipo de comportamientos por parte de un compuesto durante los estadíos más tempranos de su desarrollo. El análisis del perfil genotóxico incluye, además de la realización de los ensayos exigidos por las Agencias Reguladoras, la interpretación de los resultados, la implicación y el asesoramiento en las fases de diseño previas al inicio, y las estrategias a seguir en el caso de que las pruebas in vitro detecten actividad genotóxica del fármaco.

En nuestras instalaciones disponemos de una variada batería de ensayos in vitro e in vivo para la completa evaluación de la genotoxicidad de una sustancia o fármaco, dentro de los cuales se incluyen los siguientes:

1. Test de AMES: test de toxicidad y mutagenicidad

2. Test de MiniAMES

3. Test SOS/umu

4. Ensayo del cometa

5. Ensayo del micronúcleo

Test de Ames

Es imprescindible conocer los efectos que una sustancia puede ocasionar sobre el material genético antes de sacarla al mercado. El test de AMES es el ensayo in vitro ideal para llevar a cabo esta evaluación, ya que nos permite conocer la toxicidad general y la mutagenicidad de una sustancia sobre cinco cepas bacterianas diferentes. En nuestro departamento se realizan dos ensayos distintos, generando entre ambos una información completa y robusta sobre el perfil genotóxico de la sustancia a estudiar.

Test de AMES: Test de toxicidad. Se trata de un ensayo capaz de aportar una información muy útil acerca de las concentraciones a las cuales una sustancia es capaz de generar daño genético sobre las bacterias. De manera adicional, nos proporcionará información relativa a la solubilidad del producto, evitando problemas posteriores para otros ensayos.

Test de AMES: Test de mutagenicidad. En esta segunda variante, el objetivo del ensayo es conocer en profundidad la capacidad mutagénica de una sustancia, permitiendo saber si ese efecto mutagénico se debe al producto o a alguno de sus metabolitos.

En nuestro laboratorio tenemos también puesto a punto el Test de AMES “enhanced” para impurezas de tipo nitrosamina: test de toxicidad y mutagenicidad. Una variante del test de Ames exigido por las autoridades reguladoras

Test de MiniAMES

Este ensayo constituye una versión reducida del ensayo completo de AMES, lo que permite utilizarlo como prueba en la fase de screening o de selección de productos, ya que requiere de una menor cantidad de producto de ensayo, reactivos y células.

Al igual que ocurre con el Test de AMES, en nuestras instalaciones se llevan a cabo dos ensayos de MiniAMES independientes, uno de toxicidad general y uno de mutagenicidad. Combinando los resultados de ambos, se obtiene una información completa y muy útil a la hora de estudiar el perfil genotóxico de uno o varias sustancias.

Test de MiniAMES: Test de toxicidad. Este ensayo nos permitirá conocer la dosis a partir de la cual una determinada sustancia es tóxica para las células, así como información referente a su solubilidad. De esta forma, se evitarán problemas posteriores para otros test.

Test de MiniAMES: Test de mutagenicidad. Por su parte, este ensayo se centra en conocer en profundidad la capacidad mutagénica de las sustancias, permitiendo saber si ese efecto mutagénico se debe al propio producto o a alguno de sus metabolitos.

Test de SOS/umu

El test SOS/umu es un ensayo de genotoxicidad in vitro basado en la bacteria Salmonella Typhimurium (cepa TA1535/pSK1002) que detecta el daño al ADN mediante la inducción del sistema de reparación SOS. Cuando se produce una lesión genotóxica, se activa el gen reportero umuC, cuya actividad se mide fácilmente a través de una reacción colorimétrica, lo que permite un cribado rápido y automatizado de compuestos químicos.

Aunque no tiene validez regulatoria plena por sí solo; es decir, no sustituye al test de Ames en los paquetes de datos obligatorios exigidos por agencias como la EMA o la FDA. Sin embargo, es ampliamente aceptado y utilizado como una herramienta de cribado (screening) de alta eficiencia en las etapas tempranas del desarrollo de fármacos y en la monitorización de la calidad del agua (bajo normas ISO).

Ensayo del cometa

Este ensayo se utiliza para evaluar la capacidad genotóxica de un compuesto. La genotoxicidad en este caso, se detecta en base al número de roturas en el ADN que pueda llegar a producir el compuesto estudiado. En nuestro departamento, se ensayan dos modelos de este test, el estándar y el realizado en combinación con la enzima FPG, que permite también detectar bases oxidadas y alquiladas. Se trata de un método en alza, capaz de detectar genotoxicidad de forma muy precisa y eficaz.

Como empresa puntera en la ejecución de esta técnica, el departamento ofrece distintas opciones para la realización de este tipo de ensayo. Existen varias variantes del mismo, las cuales permiten realizar el test tanto en células obtenidas in vitro, como en células obtenidas in vivo, existiendo la posibilidad en esta última variante de emplear células procedentes de tejidos frescos o congelados.

Ensayo del micronúcleo

Se trata de un ensayo capaz de detectar los efectos genotóxicos que presenta un compuesto sobre un determinado tipo celular a través de la presencia de micronúcleos (MN), pequeños núcleos independientes y adicionales al núcleo principal de las células, relacionados con la presencia de aberraciones cromosómicas estructurales o numéricas.

Esta técnica está desarrollada para realizarse tanto en células obtenidas in vitro, como en células obtenidas in vivo.

El potencial citotóxico de una sustancia se define como la capacidad de un producto para generar una alteración de las funciones celulares básicas, provocando un daño perjudicial para la célula, de manera que afecte a su viabilidad. En el desarrollo de un nuevo fármaco es imprescindible tener conocimiento acerca perfil citotóxico del mismo, ya que permite prever los efectos que presentará dicho compuesto durante su desarrollo preclínico y/o clínico posterior.

La realización de ensayos capaces de detectar esta citotoxicidad y valorar la viabilidad celular se hace indispensable a la hora de desarrollar un nuevo producto, permitiendo obtener información de gran utilidad para investigadores interesados en la toxicidad básica de una sustancia. Existe la posibilidad de caracterizar dicho perfil citotóxico en diferentes modelos celulares, pudiendo realizarse ensayos sobre cultivos primarios, explantes de tejidos o líneas celulares establecidas.

El Departamento de Toxicología de Universidad de Navarra lleva más de dos décadas especializado en la realización de una amplia variedad de estudios de citotoxicidad y viabilidad celular, así como en el asesoramiento tanto en la fase de diseño de proyectos, como posteriormente durante la evaluación de los resultados obtenidos. Entre los diferentes estudios que se llevan a cabo se incluyen los siguientes:

1. Ensayo de reducción del MTT

2. Ensayo de captación de rojo neutro

3. Ensayo de proliferación

4. Ensayo de estimación de la viabilidad celular por exclusión del colorante azul tripán

5. Ensayo de clonación

6. Ensayo de biolumniscencia del ATP

7. Ensayo de citotoxicidad por liberación de LDH

8. Producción de ROS (ensayo de la diclorofluoresceína)

Ensayo de reducción del MTT

El ensayo de reducción del Bromuro de (3-4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazol), más conocido como MTT, es uno de los más extendidos a nivel mundial y uno de los ensayos con mayor número de aplicaciones en investigación. El MTT es una sal capaz de reaccionar con las deshidrogenasas mitoncondriales para formar cristales azules de formazán solubles, cuya absorbancia puede medirse, siendo proporcional a la cantidad de células viables.

Esto le permite tener varias aplicaciones:

• Como ensayo de citotoxicidad, para evaluar la muerte celular tras la exposición de las células a un producto de ensayo

• Para cualquier ensayo que requiera conocer el número o porcentaje de células que crecen en una determinada condición

• Para estudiar la proliferación celular

Ensayo de captación del rojo neutro

El ensayo de captación del colorante clorhidrato de 2-amino-3-etil-7-dietil amino fenacina, también conocido como rojo neutro, se basa en la medida de absorbancia de ese colorante en las células, en las que se encuentra unido a los lisosomas gracias a su capacidad de atravesar la membrana plasmática. Esta medida es directamente proporcional al número de células vivas existente, de forma que permite conocer de forma fiable el daño o muerte celular que es producido por un producto de ensayo añadido previamente, al ser comparado con los controles.

Esto hace que pueda ser aplicable en distintos estudios:

• Como ensayo de citotoxicidad, para evaluar la muerte celular tras la exposición de las células a un producto de ensayo

• Para cualquier ensayo que requiera conocer el número o porcentaje de células que crecen en una determinada condición

• Para estudiar la proliferación celular

Ensayo de proliferación celular

Se trata de un ensayo basado en la comparación de la capacidad de supervivencia de células tratadas con un determinado producto de ensayo frente a células normales. Su básico fundamento y el corto periodo de tiempo que requiere para la obtención de resultados, hacen de este método uno de los más eficaces a la hora de evaluar el perfil citotóxico de un compuesto.

Ensayo de estimación de la viabilidad celular por exclusión del colorante azul tripán

El ensayo de exclusión de colorante se emplea frecuentemente para determinar la proporción o el número de células viables presentes en una suspensión celular. Esto es especialmente útil a la hora de determinar y cuantificar el modo en el que actúa un determinado compuesto de ensayo sobre un tipo celular. El colorante azul tripán es capaz de penetrar únicamente en las células muertas o dañadas, por lo que será posible calcular la viabilidad celular tras el tratamiento con una determinada sustancia.

Ensayo de clonación

La determinación de la eficiencia clonogénica de las células después de haber sido sometidas a un determinado producto de ensayo, constituye una medida directa de la integridad reproductora de las mismas. El ensayo de clonación busca el potencial de un producto para erradicar esa capacidad de las células para dividirse indefinidamente, comúnmente asociada a células tumorales.

Esto hace del ensayo de clonación una herramienta muy eficaz a la hora de:

• Conocer el número o porcentaje de células que, después de un determinado tratamiento con un producto de ensayo, sobreviven y son capaces de multiplicarse hasta formar colonias visibles de células

• Conocer la eficiencia clonogénica de una determinada línea celular

• Estudiar la proliferación celular

Ensayo de biolumniscencia del ATP

Este ensayo se basa en la medición de la luminiscencia emitida en el proceso catalizado por la enzima luciferasa, la cual reacciona con el oxígeno en presencia de ATP, emitiendo dicha luminiscencia. Cuando el ATP es el factor limitante, la medida de luminiscencia emitida es proporcional a la cantidad de ATP que generan las células, lo cual va a asociado directamente al número de células existente.

Esto hace que este ensayo esté dotado con varias potenciales aplicaciones:

• Como ensayo de citotoxicidad, para evaluar la muerte celular tras la exposición de las células a un producto de ensayo

• Para estudiar la proliferación celular

• Como medida indirecta de bacterias, hongos, levaduras y otros microorganismos en productos alimentarios, bebidas, agua, cosméticos u otros productos.

• Como ensayo de las enzimas que producen o degradan el ATP

Ensayo de citotoxicidad por liberación de LDH

Este ensayo está fundamentado en la medición de la cantidad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima citosólica muy estable que solamente aparece en el medio de cultivo tras la lisis de la membrana de células muertas o afectadas por un agente tóxico. De esta manera es posible determinar hasta la mínima citotoxicidad de un producto de ensayo, ya que la cantidad de LDH en el medio será directamente proporcional al número de células dañadas.

Son varias las aplicaciones de este ensayo:

• Evaluar la citotoxicidad de un determinado compuesto o algún otro agente, siendo posible detectarla en estadíos muy tempranos de su desarrollo

• Calcular el número total de células que crecen o mueren bajo una determinada condición

• Evaluar la citotoxicidad mediada por otras células

Producción de ROS (ensayo de la diclorofluoresceína)

Este ensayo in vitro se centra en la medición de las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) presentes en el medio de cultivo. Se sabe que las ROS desempeñan de forma habitual distintas funciones dentro de la célula, por lo que cualquier alteración que se produzca en estas últimas variará la concentración de dichos compuestos. El tratamiento celular con un determinado producto de ensayo puede producir toxicidad celular, que se podrá detectar a través de la medición de estas ROS, haciendo de esta técnica una herramienta muy útil en la evaluación de la citotoxicidad de un producto y la viabilidad celular.

Cuando se está desarrollando un nuevo compuesto es muy frecuente tener que conocer el efecto que éste puede provocar sobre la piel. La potencial toxicidad dérmica debe detectarse en las fases más tempranas del desarrollo del producto, para lo cual existen varios ensayos y pruebas capaces de determinar y cuantificar esa toxicidad. En nuestras instalaciones contamos con las técnicas más avanzadas para ello, las cuales incluyen los test de irritación y corrosión dérmica, y los test de fototoxicidad dérmica.

El compromiso de la Universidad de Navarra para la integración del principio de las 3Rs ha llevado al nuestro departamento a la búsqueda de nuevos sistemas experimentales in vitro capaces de reproducir de manera precisa las condiciones de modelos experimentales in vivo. Esto ha hecho posible la realización in vitro de ensayos que antiguamente se realizaban en otros modelos, siendo capaces de ofrecer una información muy útil y fiable sin la necesidad de utilizar sistemas in vivo.

Ensayos de irritación y corrosión dérmica

La utilización de modelos in vitro es aplicable en muchos casos para estudios de toxicidad dérmica. En nuestros laboratorios se ofrece la posibilidad de realizar estudios de irritación y corrosión dérmica en el sistema experimental conocido como EPIDERM o Reconstructed Human epidermis (RHE), modelo que reproduce de forma fiable la epidermis humana.

• El ensayo de irritación dérmica tiene como objetivo evaluar el potencial irritante dérmico tanto de un producto determinado como de una mezcla, para poder clasificarlos de acuerdo a United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (UN GHS).

• El ensayo de corrosión dérmica por su parte, se centra en la evaluación del potencial corrosivo dérmico tanto de sustancias concretas como de mezclas, para así poder clasificarlas según United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (UN GHS).

Ensayos de fototoxicidad dérmica

El estudio del potencial fototóxico de una sustancia es imprescindible para la previsión de los posibles efectos negativos que pueda ocasionar en la piel. En nuestro Departamento cabe la posibilidad de llevar a cabo el ensayo de fototoxicidad empleando el modelo in vitro EPIDERM.

El Departamento de Toxicología de la Universidad de Navarra cuenta con un laboratorio especializado en el análisis de muestras biológicas. Una amplia trayectoria avala a nuestro personal técnico para la realización de distintos análisis biológicos, todo ello siguiendo las pautas de la legislación española para el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPLs). Nuestros especialistas cuentan con las mejores instalaciones, dotadas con los últimos sistemas y equipos de medición para la realización de las distintas pruebas, entre las cuales se incluyen análisis bioquímicos, hematológicos, pruebas de coagulación y análisis de orina.

Análisis bioquímico

Nuestros equipos permiten analizar bioquímicamente muestras de suero y/o plasma, pudiendo obtenerse información relativa al siguiente listado de parámetros:

Análisis hematológico

Nuestro laboratorio de análisis cuenta con equipos certificados para la medición de distintos parámetros en sangre entera, entre los cuales se incluyen:

Pruebas de coagulación

En nuestros laboratorios también es posible realizar pruebas de coagulación en plasma, pudiéndose determinar una serie de parámetros distintos que se muestran a continuación:

• PT (Tiempo de protrombina)

• APTT  (Tiempo de tromboplastina activada)

• Fibrinógeno  (factor I)

En nuestras instalaciones se dispone de los más especializados equipos para la realización de análisis de orina, siendo posible obtener información relativa a los siguientes parámetros:

Existe también la posibilidad de realizar ensayos ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay o Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas). Esta técnica bioquímica permite la detección y cuantificación de sustancias —como proteínas, anticuerpos o fármacos— mediante el uso de anticuerpos específicos y una reacción enzimática que genera una señal medible. Se ofrecen ensayos ELISA, con especial enfoque en la cuantificación de citoquinas inflamatorias en distintas matrices biológicas.

Analizamos, entre otros marcadores, IL1α e IL6 en medio de cultivo en estudios de epidermis humana reconstituida; y en suero o plasma se determinan IFNγ, TNFα e IL6 en mono; IgE, IL12 e IL6 en rata; así como IL6, TNFα e IFNγ en ratón. Asimismo, se ofrece la posibilidad de ampliar el panel analítico y adaptarlo a las necesidades específicas de cada proyecto.

La actividad de un medicamento frente a distintos grupos de microorganismos (bacterias, mohos, levaduras) se puede determinar por el efecto que ejerce sobre el metabolismo de los microorganismos (destrucción o inhibición del crecimiento). Esta actividad se define como la capacidad intrínseca del compuesto para interferir en procesos esenciales de la célula microbiana (como la síntesis de la pared celular, la replicación del ADN, la síntesis proteica o la integridad de la membrana), provocando la inhibición del crecimiento (efecto bacteriostático o fungistático) o la muerte del microorganismo (efecto bactericida o fungicida).

Esta actividad se puede medir in vitro mediante diferentes metodologías y puede compararse con la producida por sustancias de referencia, que hayan demostrado su acción frente a determinados microorganismos según estándares internacionales (CLSI, EUCAST).

• Antibiogramas: son pruebas microbiológicas que permiten determinar la sensibilidad o resistencia de una bacteria u hongo a distintos antibióticos/antifúngicos. Este análisis es fundamental en el campo de la microbiología clínica para guiar el tratamiento adecuado de infecciones bacterianas. Son métodos de difusión en agar en donde se colocan discos impregnados con la sustancia a ensayar sobre una placa de cultivo inoculada con el microorganismo a testar. Se mide el halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco.

• Métodos turbidímetros: se realizan por microdilución en placa, en donde se ensayan concentraciones decrecientes del producto en medio líquido para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) y/o Concentración Mínima Fungicida (CMF). La CMI es la concentración más baja de un agente antimicrobiano (expresada en μg/ml) que impide el crecimiento de un microorganismo (en condiciones in vitro definidas), mientras que la CMB o CMF es la concentración más baja de un agente antimicrobiano capaz de producir en condiciones in vitro la muerte del 99,9% de la población de microorganismos inicial.

• Determinación de la CMI en medio sólido: consiste en preparar placas de agar que contengan concentraciones decrecientes de un antimicrobiano. Una vez solidificado el medio, se inocula en la superficie de cada placa una suspensión estandarizada del microorganismo. Tras la incubación a la temperatura y tiempos adecuados, se evalúa el crecimiento en cada concentración, determinándose la CMI como la menor concentración del producto en la cual no se observa crecimiento visible del microorganismo.

Los conservantes antimicrobianos son sustancias químicas que se añaden a productos (como alimentos, medicamentos, cosméticos o productos industriales) con el objetivo de inhibir el crecimiento o destruir microorganismos (bacterias, hongos, levaduras, mohos, etc.) que podrían alterar su calidad, seguridad o estabilidad. Los mecanismos de acción sobre los microorganismos son diversos (alteración de la membrana celular, inhibición de enzimas esenciales para su metabolismo, interferencias en la replicación del ADN,…) y el resultado es la inhibición del crecimiento de los microorganismos o bien la reducción significativa de los mismos en un tiempo determinado. 

Este estudio consiste en inocular el producto de ensayo con una cantidad conocida de microorganismos y determinar su viabilidad en intervalos de tiempo a una determinada temperatura. La eficacia de los conservantes será adecuada si en las condiciones ensayadas se produce un descenso significativo y/o ningún aumento (según los casos) del número de microorganismos. 

Con estos estudios se pretende garantizar la calidad microbiológica de los medicamentos que han sido almacenados durante tiempos variables en determinadas condiciones de temperatura y humedad (cumplimiento de los criterios microbiológicos establecidos por las Farmacopeas). Estos estudios incluyen:

• Validación de los métodos de control microbiológico: se trata de demostrar que la técnica microbiológica aplicada permite recuperar o detectar el microorganismo diana en presencia del producto farmacéutico, eliminando la posible inhibición que pudiera producir el principio activo y los consiguientes falsos negativos. Disponemos de una colección de cepas de referencia para fortificar las muestras y comparar la recuperación de los microorganismos en presencia y ausencia del medicamento. 

• Control microbiológico en medicamentos: realización de los ensayos microbiológicos solicitados aplicando el método de control previamente validado.

Los ensayos microbiológicos que se llevan a cabo en los estudios de estabilidad son los siguientes:

• recuento de microorganismos aerobios totales (TAMC) 

• recuento de mohos y levaduras totales (TYMC)

• recuento de Bacterias Gram negativas bilis tolerantes 

• investigación (detección) de Escherichia coli

• investigación (detección) de Bacterias Gram negativas bilis tolerantes 

• investigación (detección) de Pseudomonas aeruginosa

• investigación (detección) de Staphylococcus aureus

• investigación (detección) de Salmonella spp

El laboratorio de Microbiología también oferta otros ensayos microbiológicos en productos farmacéuticos, siguiendo las directrices de las Farmacopeas.

• Validación de medios de cultivo (promoción del crecimiento y propiedades inhibitorias):  consiste en comprobar que los medios empleados en el control microbiológico de productos farmacéuticos son capaces de favorecer el crecimiento de los microorganismos diana (o en su caso, la inhibición), asegurando así que el medio es adecuado para su uso. Se utilizan concentraciones conocidas de las cepas de referencia y se compara la recuperación (y en su caso inhibición) de los microorganismos en el medio a validar respecto al medio de cultivo usado como control (previamente validado).

• Control microbiológico de aguas para inyectables: se trata de comprobar que el agua utilizada en las formulaciones para inyectables cumple con los requerimientos de la Farmacopea, para garantizar la calidad microbiológica del producto final y cumplir con los requisitos de Buenas Prácticas de Fabricación.

• Ensayo de esterilidad: el objetivo es confirmar la ausencia total de bacterias, mohos o levaduras en productos de uso médico o farmacéutico, que según Farmacopea deben ser estériles. Antes de llevar a cabo el ensayo de esterilidad es necesario validar el procedimiento de análisis (llevando a cabo fortificaciones con cepas de referencia), con el fin de demostrar que, en caso de estar presentes, somos capaces de detectar los microorganismos, eliminando la posible inhibición que pudiera producir el principio activo y los consiguientes falsos negativos. El ensayo se puede realizar por filtración o por inoculación directa, siendo el primero de ellos la opción de elección siempre que sea posible.